CRISPR Çeşitleri

(Bu yazı GENÇ İVEK SAĞLIK BİLİM VE TEKNOLOJİLERİ DERGİSİ’nin 7. sayısında yayımlanmıştır.) 

LOKMAN TUNCA

Biruni Üniversitesi

Tıp Fakültesi – Lisans Öğrencisi

Önceki yazımızda genel olarak CRISPR teknolojisinin ne olduğundan, etkisini nasıl gösterdiğinden ve Çinli Doktor He’nin çalışmalarıyla HIV’e karşı bağışıklık kazandığı iddia edilen ikizlerden bahsetmiştik. Bu yazımız ise ilk yazımızın devamı niteliğinde olacak ve çok sayıda bulunan CRISPR çeşitlerinden en bilinenleri ve en çok kullanılanları üzerine odaklanacaktır. CRISPR hakkındaki ilk yazımız Genç İVEK dergisinin 5. Sayısında bulunmaktadır. Öncelikle onu okumanızı tavsiye ederiz. Nobel Ödülleri tarihinde belki de en hızlı ödül alan çalışması olan CRISPR teknolojisinin devam yazısının böyle bir zamanda gelmesi güzel bir çakışma oldu.

Sık Kullanılan CRISPR Çeşitleri ve Özellikleri

A- Cas9 Nickase

Cas9 enziminin kesim aktivitesi bulunan bölgelerinden birinde mutasyon oluşmasıyla çift zincir değil tek zincir kırığı gerçekleşir. (Nickase)  Çift taraflı, farklı yerlerden kesim yapılmasıyla off-target (Cas9 enziminin genomu yanlış yerden kesmesi) oranı düşürülebilir. Yerleştirilmek istenen gen bölgesinin genoma entegrasyonu daha kolay olur. (Şekil 1)

B- Dead Cas9 (dCas9)

Cas9 enziminin kesim aktivitesi bulunan iki bölgesi de mutasyona uğradığında iki zincirin de kırılmasını önlenir. Böylece sgRNA bölgeyi tanır ama kesemez. Buna deadcas9 denir. Genom üzerine yerleşen Cas9 proteini nedeniyle RNA polimeraz (DNAàRNA) genomu transkripte edemez ve gen knock-down olmuş olur. dCas9’a etiket proteinler eklenerek çeşitli görevler yaptırılabilir. Çok fazla kullanım alanı vardır. (Şekil 2)

B.1- CRISPR Interference

CRISPRi, dCas9 a Repressor domain (KRAB) eklendiği zaman oluşur ve gen transkripsiyonun baskılanmasını sağlar. Fazla protein sentezi bulunan hastalıkların tedavisinde geni susturmak yerine transkripsiyonu azaltmak için kullanılabilir. Ancak transkripsiyonu etkilemek için sgRNA’nın bağlanacağı genom bölgesi seçilirken promoter (genin transkripsiyona başlanan bölgesi) bölgesine yakın seçilmesine dikkat edilmesi gerekir. (Şekil 2.1)

B.2- CRISPR Activator

CRISPRact, dCas9’a aktivatör domainler (VP64,p65) eklendiği zaman oluşur ve genin transkripsiyonunu arttırır. Gen transkripsiyonunu arttıran domainler aynı anda kullanılarak sinerjetik etki oluşması sağlanabilir. (Şekil 2.2.2) (1000 kata kadar gen ifadesi artabilir) CRISPRi de olduğu gibi transkripsiyonu etkilemek için sgRNA’nın bağlanacağı genom bölgesi seçilirken promoter bölgesine yakın seçilmesine dikkat edilmesi gerekir (Şekil 2.2.1)

B.3- CRISPR ile Epigenetik Modulasyon

dCas9 ile epigenetik modifikasyonlar yapılabilir. Böylece gen aktivasyonu veya inaktivasyonu gerçekleştirilebilir. Örnek olarak p300 histon deasetilaz enziminin dCas9 a bağlanması ile histondaki asetil grupları uzaklaştırılır veya aksine başka enzim kullanılarak asetillenebilir. (Şekil 2.3)

B.4 CRISPR Görüntüleme

dCas9 üzerine florofor proteini bağlanarak görüntüleme yapılabilir (Sekil 2.4.1). Genin kromatit üzerinde lokasyonu bulunabilir. Duplikasyon delesyon gibi kromozomal patolojiler araştırılabilir. Şu an kullanılmakta olan FISH gibi bazı görüntüleme tekniklerinin yerine kullanılabilir. (Şekil 2.4.2)

C- Cpf1 ve Cas9 enzimine göre avantajları Cpf1 enzimi Cas9 enziminden sonra keşfedilen, Cas9’a göre avantajları bulunan bir emzimdir. Cas9’da crRNA ve tracrRNA (toplam ⁓100 nt) gerekliyken Cpf1’da sadece crRNA (⁓50 nt) yeterlidir. Cpf1 enziminin kendisi de Cas9’dan daha küçüktür. Bu özelliği Cpf1’in adenovirus gibi küçük virüslerle taşınabilmesine olanak sağlar. Cpf1’in en önemli özelliklerinden biri genomda belirlenen bölgeyi künt olarak (iki zincirde de aynı yerden) kesmek yerine yapışkan uç şeklinde (iki zincirde farklı yerlerde) kesmesidir. Bu özelliği sayesinde gen ekleme daha rahat yapılabilmektedir. (Farklı bölgeler için iki Cas9 Nickase kullanmış gibi) Ayrıca Cpf1’in kesim yeri PAM dizisinden (kesim için genomda bulunması gereken anahtar nükleotid dizisi) uzaktadır. Böylece kesim sonrası PAM dizisi zarar görmez ve aynı yerden tekrar kesim yapılabilir. Cas9 ile gen editlemekten daha az maliyetli olan Cpf1 enzimi için PAM dizisi TTNşeklinde olup Cas9 için gerekli olan guaninden zengin genom gereksinimine (Cas9 için PAM dizisi:NGG) alternatif olmuştur. (Şekil 3)

Kaynaklar

1-T101 CRISPR Genom Modifikasyonları

2-CRISPR/CAS9 genome editing: potential for human modification- Paul Thomas

3-CRISPR Therapeutics

4-H. NISHIMASU ET AL.

5-Bortesi L et al. Biotechnol Adv. 2015

6- Applied Biological Materials